· poliakrilamidaGela akrilamida monomeroz, polimerizazio hasierako materialaz, katalizatzailez eta gatz eta buffer nahasketaz osatuta egon behar da.
· akrilamidaeta BIS (N, N'-metileno akrilamida bikoitza) monomero formako gel matrizea da.
· amonio persulfatoak itsasgarriaren polimerizazio prozesua abiarazten du. Kolaren formulazioak uretan prestatutako % 10eko amonio persulfato disoluzioa behar du. Informazio gehienak erabilera aktiboaren beharra adierazten zuen. Hala ere, % 10eko disoluzioa 4 ℃-tan jar daiteke hainbat astez jarduera-galera nabarmenik gabe. Gehitu 10 ml-raino eta bota kola ez denean bat egiten.
Aholkua: ehunekoaakrilamidaSekuentziazioan kola eta proteina kola ez dira berdinak. Aurrez egindako akrilamida: BIS disoluzioa erabiltzen baduzu, ziurtatu botila egokia lortzen duzula.
· TEMED (N, N, N', N'- tetrametil etilendiamina) katalizatzaile bat da, botila marroi batean, hozkailuan sartuta. Kola bota aurretik gehitu.
· Elektroforesian erabilitako poliakrilamidazko beira garbitu behar da aldi bakoitzaren aurretik eta ondoren. Elektroforesiaren ondoren, garbitu eskuila leun batekin eta zapi batekin ur bero eta xaboitsuarekin, garbitu ur destilatuarekin eta lehortzen utzi.
· Polimero hutsak hezetasuna eta hautsa sor ditzake. Elektroforesi aurretik, garbitu beirazko plaka beira-garbitzaile batekin eta eskuila leun batekin. Garbitu ur destilatuarekin eta lehortu ondo paperezko zapi batekin. Paperarekin garbitu aurretik % 70eko etanolarekin garbitzeak garbitzen eta lehortzea bizkortzen laguntzen du. Gehitu akrilamida laginak bata bestearen atzetik: BIS, ura, buffer soluzioa, amonio persulfatoa, TEMED. Ondo astindu eta bota berehala.
Ez da beharrezkoa poliakrilamida desgasifikatzea polimerizatu aurretik. (Akrilamida hutsean jartzen zen burbuilak kentzeko, oxigenoak polimerizazioa inhibitzen baitzuen.)
Kola-puntu horizontalen lagin-puntak.
· Jarri paper beltz zati bat beheko kaxan, atzealde beltzarekin, laginaren zulo bat egiteko eta argiago ikusteko.
· kola-tangarekin betetako bufferra, koloidearen gainean.
· ertzak argia badu, piztu argiak, utzi koloideak argia distira egiten. Marraztu lagina pipetaren barruan.
· pipetatzeko gailua automatikoa erabiliz.
· 10-200 mu-tan, likido mugikor bat erabil daiteke laginaren puntu gehienetan. Laginaren zulo oso txikietarako (10μ1 baino gutxiago), sekuentziazio-kola egiteko erabiltzen den pipeta-buru luzea komenigarriagoa da.
· pipetatzea laginaren barruan murgilduta, poliki mugitzen den fluidoa arnastuz. Lagina glizerinarekin itsaskorra izan daiteke, eta ponpaketa azkarrak aire burbuilak pipetaren buruan sar ditzake.
· Pipetatzeko burua arnastu ondoren, fluido-burua astiro mugituko da hodiaren ertzean edo, papera garbituz, likido-burua tantaetatik kanpora xurgatuko da. Kontuz ibili lagina ez xurgatzeko.
Jarri lagina lagin-zuloan
· Pipetatzeko gailua presio txiki bat mantentzeko, laginak gainezka egiten duen likidoaren burua apur bat mugiaraziz.
· Pipetatzeko burua bufferrean sartuta, puntu-zuloak baino zertxobait gorago, presio positiboa mantentzen du. Pipetaren punta zulo txiki batean sar daiteke.
· laginak poliki eta etengabe ateratzen dira. Pipeta punta lagin-zuloaren gainean jartzen da, eta lagina zuloan hondoratuko da. Utzi lagina hondoratzen lagin-zuloa betetzeko, barrura bultzatu beharrean.
· Laginaren azken tanta likido-buruarekin batera, likidoa bigarren hankara mugituko da, poliki-poliki igoko da likidoa mugitzeko, bufferretik ateratzeko
Nola egin kola bertikalaren laginketa?
· bi beira zatiren artean sortutako kola-puntuko lagin-zulo bertikalak. Kola oso mehean, pipetaren burua ezin da bi beirazko plaken artean sartu ere egin. Kontuz glizerinarekin! Jarri pipetaren burua lagin-zuloaren gainean eta lagina zuloan hondoratuko da.
· Laginaren zuloa polipropileno azil gelaren puntu bertikala jarri aurretik, ziurtatu ondo garbituta dagoela. Garbitu polimerizatu gabeko akrilamida eta laginaren zuloaren behealdean ager daitekeen ura. Urak laginaren zuloa nabarmen txikiagoa egin dezake. Erabili 25 ml-ko edo 50 ml-ko xiringa bat eta 18 kalibreko orratz bat. Bota elektroforesi bufferra eta garbitu laginaren zuloa arretaz.
· zaila izan daiteke laginaren zuloa ikustea, baina, aldi berean, gainerakoa erraza da. Zulo gehiegi badaude, laginaren bufferra bromofenol urdinarekin probatu daiteke.
Argitaratze data: 2023ko martxoaren 31a